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【伯豪生物】解鎖外泌體 | 外泌體樣本收集

2019-10-14點擊27次
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外泌體是由細胞分泌的納米級膜性小囊泡,直徑約30~150nm。外泌體來源多樣,廣泛存在并分布于各種生物液體中,富含來源細胞的蛋白質、脂質和核酸,參與細胞間的信息交流。不同病理和生理條件下,外泌體的內容物不盡相同,因此外泌體可以很好地反映生物體的疾病與健康狀態。此外,外泌體特殊的膜結構能夠保護其內容物如RNA(microRNA、mRNA、lncRNA、circRNA)免受酶的降解,保證其能在各類體液中被穩定檢測到,因此外泌體是研究各種疾病的良好生物學材料,可作為腫瘤潛在的biomarker和治療靶點,亦可作為基因/藥物的遞送載體,在疾病的診斷和治療方面具有廣闊的應用前景。


圖1 外泌體的形成與分泌

據統計,2019年國自然中標的外泌體相關項目總計600多項,總金額高達2.5億,相較2018年,總金額增長了44.5%,足可見外泌體研究的火熱程度。近幾年,隨著高通量檢測技術的飛速發展,對外泌體進行組學研究極大地推動了外泌體的研究進展。伯豪生物致力于科研服務,擁有高標準的樣品處理平臺、微陣列芯片平臺、高通量測序平臺、生物標志物平臺、生物信息分析平臺等多個平臺,能夠實現外泌體分離、鑒定、內含物(蛋白質、mRNA、ncRNA)檢測及驗證的“一站式”外泌體研究服務。

那么如何開展外泌體研究,第一步也是相當重要的一步就是收集外泌體含量高的樣本。外泌體存在于各種生物體液中,如血液、乳汁、尿液,腦脊液,那么如何有效的收集各種類型的樣本用于后續的外泌體分離呢,下面我們來簡單介紹下各類型外泌體樣本的具體收集方法。



圖2 外泌體的來源及內含物

血清

注意:收集血清樣本時一定不能加入抗凝劑。

1) 采集外周血(建議早晨空腹抽血),迅速轉入不含EDTA的試管中,渦旋或顛倒混合5~10 次;

2) 室溫(22℃~25℃)下靜置30分鐘,或4℃下靜置3~4小時,可見血塊自行凝固;

3) 吸取上清至新的離心管中,4℃,8200×g離心10分鐘;

4) 吸取上清至新的離心管中,4℃,16000×g離心10分鐘;

5) 小心吸取上清至新的離心管中(1.5ml離心管,每管不超過1ml), -80℃保存;

6)干冰寄送樣本。

提示:建議送樣量5 mL 以上(大致需全血8-10mL)

血漿

注意:收集血漿樣本用于RNA研究時一定不要用肝素抗凝管。

1) 采集外周血(建議早晨空腹抽血),迅速轉入EDTA抗凝管中,渦旋或顛倒混合5~10 次;

2) 在1小時(室溫)或2小時(4℃)內進行血漿分離,8200×g離心10分鐘;

3) 吸取上清至新的離心管中,4℃,16000×g離心10分鐘;

4) 小心吸取上清至新的離心管中(1.5ml離心管,每管不超過1ml),-80℃保存;

5)干冰寄送樣本。

提示:建議送樣量5 mL以上(大致需全血8-10mL)


Tips: 血液樣本外泌體研究血清好還是血漿好?

血漿=血液-血細胞;血清=血漿-纖維蛋白原-凝血因子;血清是血液凝固之后收集的液體,在凝血過程中血小板會分泌大量的外泌體,有研究發現血清中有接近50%的外泌體來自額外的分泌,所以一般實驗會選擇血漿。在特殊情況下,如研究與血小板相關疾病的時候,血清比血漿更適合。此外,在采血后最好盡快處理樣本,因血液收集到收集管后,血細胞和血小板會繼續分泌外泌體

細胞上清

注意:細胞培養基必須使用去除外泌體的血清或者無血清培養基

1) 正常含有血清的培養基中培養細胞24h左右,貼壁細胞密度達到70%~80%,懸浮細胞密度達到60%~70%;

2) 將原有血清培養基更換為去除外泌體的血清或者無血清培養基(貼壁細胞直接去除原有培養基,加入適量PBS緩沖液沖洗一次,更換新的培養基;懸浮細胞4℃,300×g離心10分鐘,收集細胞后,加入適量PBS緩沖液沖洗一次,更換新的培養基)繼續培養;

3) 培養48-72小時后,根據細胞數量確定收取上清時間;

4) 4℃,300×g,離心10分鐘收集細胞上清;

5) 4℃,3000×g,離心15分鐘,確保將細胞及細胞碎片去除干凈;

6) 吸取上清,-80℃保存;

7)干冰寄送樣本。

提示:送樣量最好在50 mL 以上,最低不少于30ml

尿液

1) 收集清晨第一次尿液50ml,注意避免細菌污染,收集前注意飲食控制,前一晚22:00后禁食禁水;

2) 4 ℃ ,3000×g,離心15分鐘,去除細胞或細胞碎片;

3) 收集上清尿液分裝轉移至15ml離心管中,-80℃保存;

4)干冰寄送樣本。

提示:送樣量最好在50 mL 以上

腦脊液

1) 收集腦脊液,收集過程中避免血液污染; 

2) 3000×g,離心15分鐘,去除細胞或細胞碎片; 

3) 收集上清,-80℃冰箱中保存;

4)干冰寄送樣本。

提示:送樣量最好在20 mL 以上

注:以上建議的送樣量綜合考慮了外泌體的表征檢測(TEM、NTA、WB)和組學研究(轉錄組、蛋白質組)的樣本需求量。上述細胞上清送樣量主要指常規腫瘤細胞,對于其他類型細胞,最好在送樣前進行預實驗,以確定外泌體含量。


收集好上述富含外泌體的生物樣本后,接下來就可以交給伯豪生物,我們會根據實際需要進行外泌體的分離。目前外泌體的分離方法中應用最廣泛的是超速離心法和試劑盒抽提法,超速離心法是外泌體分離的金標準,是高分文章常用的分離方法,獲得的外泌體純度高。其原理主要是依據外泌體與其他微小囊泡密度和大小的不同而分離,通過逐步提高離心速度,有效去除細胞、細胞碎片和大囊泡,收集高純度的外泌體。外泌體抽提試劑盒分離外泌體省時省力,外泌體純度高,如伯豪生物使用的SBI外泌體抽提試劑盒,樣本需求量少,最少可從100ul血清或5ml細胞上清中分離外泌體。利用超離或試劑盒法分離獲得的外泌體,經表征檢測確定后即可進行后續的組學研究。


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