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【伯豪生物】干貨 | 細胞表型檢測

2019-10-14點擊28次
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我們在前面,花了很多篇幅講述了Loss of Function和Gain of function的各種方法。那么我們將目的基因在細胞中敲除、敲降、過表達之后,怎樣研究其功能呢?首先可以進行的,就是細胞表型檢測。這一回,我們就來講述細胞表型檢測

細胞表型是涉及基因和蛋白表達的多個細胞過程的集合體,這些過程導致細胞特定的形態和功能。細胞表型檢測,檢測的是如下若干表型:周期、增殖、凋亡、遷移、侵襲、克隆形成、自噬、EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition,上皮間充質轉化)、血管生成。

在細胞內,將某目的基因敲除、敲降、過表達,建立穩轉株后,與對照細胞一起,檢測細胞表型,觀察每項表型的變化,可推斷該目的基因的功能。

細胞周期

細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程。細胞內的DNA含量隨著細胞周期進程發生周期性變化。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,可透過凋亡中晚期的細胞和死細胞,嵌入核酸DNA或RNA雙鏈螺旋的堿基之間,使細胞核紅染,并且熒光強度和所嵌入的核酸含量成正比。細胞周期檢測時,首先用RNA 酶將RNA消化排除影響,通過流式細胞術檢測PI熒光強度直接反映細胞各時相的DNA分布狀態,從而計算出各時相的百分率。

細胞增殖

細胞增殖是生物體的重要生命特征。細胞以分裂的方式進行增殖。單細胞生物以細胞分裂的方式產生新的個體。多細胞生物以細胞分裂的方式產生新的細胞,用來補充體內衰老和死亡的細胞;同時,多細胞生物可以由一個受精卵,經過細胞的分裂和分化,最終發育成一個新的多細胞個體。一般細胞傳代之后,經過短暫的懸浮然后貼壁,隨后經過長短不同的潛伏期,即進入大量分裂的指數生長期。在細胞達到飽和密度后,停止生長,進入平臺期,然后退化衰亡。可以用存活細胞數(萬/mL)對培養時間(h或d)作圖,得到生長曲線,可準確描述整個過程中細胞數目的動態變化。目前主要使用MTT、CCK8和Am-blue三種試劑測定細胞生長曲線。

細胞遷移

細胞遷移是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質的梯度后而產生的移動。細胞遷移為細胞頭部偽足的延伸、新的黏附建立、細胞體尾部收縮在時空上的交替過程。細胞遷移是正常細胞的基本功能之一,是機體正常生長發育的生理過程,也是活細胞普遍存在的一種運動形式。胚胎發育、血管生成、傷口愈合、免疫反應、炎癥反應、動脈粥樣硬化、癌癥轉移等過程中都涉及細胞遷移。檢測細胞遷移能力的實驗包括劃痕實驗和Transwell實驗。細胞劃痕實驗是,在體外培養皿或平板培養的單層貼壁細胞上,用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央區域劃線,去除中央部分的細胞,然后繼續培養細胞至實驗設定的時間,觀察細胞。Transwell的基本原理是將transwell小室放入培養板中,小室內稱為上室,培養板內稱為下室,上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔,上室內添加上層培養液,下室內添加下層培養液。將細胞種在上室內,由于膜有通透性,下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞,從而可以研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。

細胞侵襲

細胞侵襲實驗的目的是研究趨化因子或其他營養物質對細胞侵襲的影響。將細胞種于上室,趨化因子等種于下室,細胞會向營養成分高的下室跑。與遷移實驗不同是侵襲實驗需要在小室聚碳酸酯膜上鋪設一層基質膠。用以模仿體內細胞外基質,細胞欲進入下室,先要分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)將基質膠降解,方可通過聚碳酸酯膜。計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的侵襲能力。

細胞凋亡

細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下,遵循自身的程序,自己結束其生命的過程。它是一個主動、高度有序、基因控制的一系列酶參與的過程。磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期,PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環境中。用標記上熒光素或biotin的Annexin V(一種Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,與PS高親和力特異性結合)與PC結合,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡,即可檢測細胞凋亡的發生。將Annexin V與PI 匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

克隆形成

克隆形成是測定細胞增殖能力的有效方法之一。單個細胞在體外持續6代以上,其后代所組成的細胞群稱為克隆。這時每個克隆含有50個以上的細胞,大小在0.3-1.0 mm之間,通過計數克隆形成率,可對單個細胞的增殖潛力做定量分析,了解細胞的增殖能力和獨立生存能力。常用的方法有:平板克隆形成實驗和軟瓊脂克隆形成實驗。懸浮細胞克隆形成檢測可使用軟瓊脂克隆形成實驗。

細胞自噬

細胞自噬是通過溶酶體進行蛋白降解和細胞組分調節的過程。自噬主要受細胞內的營養匱乏刺激而產生,在生物體內發育、分化、環境脅迫和腫瘤發生中具有重要的意義。研究發現微管相關蛋白輕鏈3(MAP-LC3),簡稱LC3,參與了自噬的形成,并被證明了是哺乳動物細胞中常見的自噬小體標記蛋白之一。可在細胞中表達LC3-GFP融合蛋白,對自噬體的形成和功能進行監控。由于自噬涉及多條信號通路,可以誘導或抑制其發生。細胞自噬與個體發育、氧化性損傷保護、腫瘤細胞的惡性增殖及神經退行性疾病有關。因此,可在相關疾病研究中檢測自噬,研究基因功能。

EMT

EMT,指上皮細胞-間充質轉化的縮寫,是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程。通過Western Blot的方法檢測細胞中目的基因敲降或過表達后EMT marker蛋白表達量,可判斷目的基因表達變化后是否能抑制EMT過程的發生,從而判斷該基因是否為轉移相關基因。

血管生成

血管生成(Angiogenesis)是指源于已存在的毛細血管和毛細血管后微靜脈新的毛細血管性血管的生長。無論原發性腫瘤還是繼發性腫瘤,一旦生長直徑超過1~2 mm,都會有血管生成。這是由于腫瘤細胞自身可分泌多種生長因子,誘導血管生成。體外血管生成實驗能夠很好的模擬腫瘤血管發生過程,并且適合研究某些基因或藥物對這一過程的影響。可以通過血管內皮細胞(HUVEC)在基質膠(Matrigel)上形成血管的能力來判斷某些基因或藥物對血管形成的影響。

細胞表型典型圖


伯豪生物提供各項細胞表型檢測服務



細胞表型可大體反應出目的基因的功能,如促增殖、促凋亡等,可以對基因功能進行初步的驗證。細胞增殖、凋亡等都涉及到多條信號通路,而我們的目的分子,其敲除、敲降或過表達使細胞表型發生了變化,它是如何作用于哪條信號通路呢?要解答這個問題,請見下回:基因功能預測和信號通路研究工具

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